El muestreo de suelos rizosféricos se realizó aleatoriamente en una sección de 20x20 cm hasta obtener 10 g por cada zona (n=3), de acuerdo con la metodología reportada por Cline [²²]. Las muestras de suelos recolectadas se sembraron en los medios de cultivo PDA, Jugo V8 y Miel-Avena usando el método de cuadricula. Se incubaron por un lapso de 10 días a una temperatura de 25°C para que los hongos desarrollaran sus estructuras (i.e., micelio, conidias, fiálides, conidióforos, y vesículas), lo cual permitió la identificación macroscópica y microscópica de cada aislamiento [²³-²⁷]. Se recuperaron seis hongos en total y posterior a la identificación se etiquetaron los aislamientos como: Tr1, Tr2 y Tr3 para Trichoderma sp. y As1, As2 y As3 para Aspergillus sp.

Se recolectaron lechugas que provenían del municipio de Mosquera (Cundinamarca, Colombia) y que presentaban las características de infección producidas por el hongo Sclerotinia sp., como marchitamiento de hojas externas, lesiones de color marrón en el tejido foliar, pudrición blanda acuosa, crecimiento de micelio de color blanco y/o presencia de esclerocios [²⁸]. Estas muestras fueron recolectadas del centro de acopio Corporación de Abastos de Bogotá S.A. (CORABASTOS). Las muestras se conservaron a 4°C y se transportaron al laboratorio de Microbiología y bioprospección medioambiental (MiBioMA) de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas (Bogotá, Colombia). El aislamiento de Sclerotinia sp. Se realizó mediante la técnica expuesta por Sánchez [²⁹]. Los cortes de 5-10 mm de las hojas de lechuga infectadas se colocaron en una solución de cloro al 10% por 20 segundos, se lavaron tres veces con agua destilada, se colocaron en papel secante, y se ubicaron en el centro de los medios de cultivo PDA, Jugo V8 y Miel-Avena. Éstas se incubaron por diez días a una temperatura de 25°C.

Adicionalmente, se realizó un aislamiento a partir de esclerocios, desinfectándolos con una mezcla de hipoclorito al 70%, fenol al 5% y alcohol etílico por un tiempo de 5 minutos; los esclerocios se lavaron con agua destilada estéril y con una cuchilla estéril se cortaron para sembrarlos en los medios de cultivo de evaluación. La temperatura y tiempo de incubación fue de 25°C por 10 días [²⁹]. Se identificaron macroscópica y microscópica del hongo fitopatógeno se realizó de acuerdo con Saharan, G.S. & Mehta, N [³⁰].

Antes de realizar las pruebas de antagonismo se estimó el crecimiento radial de cada hongo aislado en los tres medios de cultivo de evaluación, midiendo el diámetro de las colonias los días 3, 7 y 10. La esporulación de Trichoderma sp y Aspergillus se realizó según Pedroza et al. [³¹] al culminar los 10 días de incubación. Para Sclerotinia se contaron los esclerocios a los 10 días de crecimiento.

Se realizaron pruebas de antagonismo contra el fitopatógeno a través de la técnica dual [³²], con las tres cepas de Trichoderma sp. (Tr1, Tr2 y Tr3) y las tres cepas de Aspergillus sp. (As1, As2 y As3). También, se evalúo el antagonismo entre ellos, así: As1 vs. Tr1, As1 vs. Tr2, As1 vs Tr3, As2 vs. Tr1, As2 vs. Tr2, As2 vs Tr3, As3 vs. Tr1, As3 vs. Tr2, As3 vs Tr3. En cada caja de Petri se marcó una línea para dividir en dos partes iguales el área de siembra, y en la mitad de cada lado se dispusieron discos de medio de cultivo con micelio de los hongos a enfrentar de 5 mm de diámetro [³³]. Los quince antagonismos se incubaron por diez días a 25°C. Cada enfrentamiento se realizó en los medios PDA, Jugo V8 y Miel-Avena. La evaluación se realizó de acuerdo con Bell et al. (1982), referenciado por Corrêa et al. [³⁴]; y se modificó cuando se enfrentaron los posibles biocontroladores teniendo la escala de notas No. 1 (Cuadro 1 y Figura 1), con base en el método de similaridad de Jaccard [³⁵].

Cuadro 1

Figura 1

Posteriormente, se evaluó el efecto antagónico entre consorcios de los posibles hongos biocontroladores contra Sclerotinia sp., así: Scl vs. Tr1+As1+As2, Scl vs. Tr1+As1+As2, y Scl vs. Tr3+As2+As3. Todas las pruebas de antagonismo se realizaron en los tres medios de cultivo y se incubaron por diez días a 25°C. Como control del crecimiento para cada hongo se sembró en los tres medios mencionados por punción central individualmente, y se comparó el crecimiento con lo observado en cada enfrentamiento. Para evaluar el efecto antagonista entre cada hongo y los consorcios frente al fitopatógeno, se definió una segunda escala de notas (Cuadro 2 y Figura 1) de acuerdo con el método de similaridad de Jaccard [³⁵].

Cuadro 2

Se aplicó un diseño experimental basado en la clasificación de conglomerados jerárquicos con medida de similaridad de Jaccard [²⁸], donde se distinguieron las relaciones entre cada una de las cepas Tr1, Tr2, Tr3, As1, As2, As3 y Scl. En la escala de similaridad se obtuvieron datos binarios, en donde cero hizo referencia a que no hubo un antagonismo mayor al 50%. En la escala de Notas 1, son las clases 2, 4 y 5; y para la escala de notas 2, son las clases 3, 4 y 5. La valoración uno (1) fue para el antagonismo igual o superior al 50%, lo que correspondió en la escala de notas 1 a las clases 1 y 3; para la escala de notas 2, las clases 1 y 2 (Figura 1).

Por último, la distribución normal de los datos se verificó mediante una prueba de Shapiro-Wilk (p-valor > 0,05) y el estadístico de Levene (p-valor < 0,05). Se determinó también el porcentaje de relación, y se comprobó el grado de similaridad mediante el método de Jaccard. Se utilizó un análisis de varianza de una vía y la prueba Tukey para estudiar las diferencias entre las variables consideradas. Todos los análisis fueron realizados mediante el programa informático SPSS V.19.

En el primer enfrentamiento dual se evaluó el efecto antagónico de las cepas de Aspergillus sp. As1, As2 y As3 frente a las cepas de Trichoderma sp. y se valoró según la escala de notas No. 1 (Cuadro 1). En el Cuadro 4 están las clases luego de valorar el efecto antagónico de cada enfrentamiento allí descrito. Se encontró que el 48,2% de los 27 enfrentamientos correspondieron a un crecimiento masivo de una cepa de Trichoderma sp., colonizando la colonia del Aspergillus sp. Un 7,41% correspondió al crecimiento masivo de una cepa de Aspergillus sp. sobre Trichoderma sp. En el 29,6% de los enfrentamientos Trichoderma sp. creció en 2/3 de la caja de Petri, y en un 11,1% lo hicieron las cepas de Aspergillus sp. Solamente en un 3,70% de los enfrentamientos las colonias crecieron ocupado prácticamente el mismo espacio sin sobreponerse las colonias (Clase 5, cuadro 1).

Cuadro 4

Igualmente, se pudo sugerir que la composición de los medios de cultivo influyó en el comportamiento de los promisorios antagonistas de Sclerotinia sp. Cuando se evalúan conjuntamente y los antagonismos no fueron homogéneos en los 27 enfrentamientos duales. Es decir, en el medio de cultivo PDA la cepa As1 frente a las cepas Tr1 y Tr3 colonizaron aproximadamente 2/3 de la caja; con la cepa Tr2 fue diferente el comportamiento, creciendo en la totalidad de la caja y sobre la colonia As1. En cuanto a la cepa As2, esta creció hasta 1/3 en el medio de cultivo de los Tr1 y Tr2; y en el enfrentamiento con la cepa Tr3, tanto Aspergillus sp. Como Trichoderma sp. Crecieron cada uno hasta 1/3 de la caja y las colonias se mantuvieron separadas. Para la cepa As3, en los tres enfrentamientos contra cualquier cepa de Trichoderma sp., la colonia fue inhibida en más de un 71,9% (Figura 2).

Los resultados evidenciaron que en el medio de cultivo Jugo V8, el comportamiento fue igual por las cepas Tr1 y Tr2 contra las cepas As1, As2 y As3; creciendo cada Trichoderma sp. En toda la superficie del medio y reduciendo la colonia de cada Aspergillus sp. Según los enfrentamientos. Esto mismo se observó entre en los enfrentamientos de As1 y Tr3, pero el efecto antagónico entre As3 y Tr3 fue que el primero colonizó toda la colonia del segundo, creciendo en toda la caja de Petri. En cuanto al enfrentamiento As2 y Tr3, el Aspergillus sp. Creció en 2/3 de la caja de Petri y el Trichoderma sp. En el espacio restante sin superponerse las colonias.

En relación con los resultados obtenidos al enfrentar los hongos promisorios como biocontroladores contra Sclerotinia sp. De manera individual y en consorcios (Cuadro 5), la cepa As3 no tuvo un efecto inhibitorio contra el fitopatógeno, por el contrario, Scl generó hasta un 200% de estructuras de resistencia (Figura 2), por esto no se incluyó en los consorcios. En el enfrentamiento individual las cepas As1, As2 y Tr3 tuvieron un mayor porcentaje de inhibición sobre Sclerotinia sp., seguidos con una menor inhibición por la cepa Tr1; pero fue la cepa Tr2 quien logró inhibir en mayor porcentaje el fitopatógeno (Figura 2).

Figura 2

Cuadro 5

Los resultados evidenciaron que el comportamiento de los consorcios frente al fitopatógeno en los tres medios de cultivo fue similar, y se encontró que el consorcio más eficiente para controlar Sclerotinia sp. Fue As1+As2+Tr2; en donde se apreció un aumento de la esporulación en el tiempo de la cepa Tr2, seguida por el consorcio As1+As2+Tr1, y el consorcio As1+A2+Tr3. En este último la inhibición de Sclerotinia sp. Fue hasta 1/3 de la superficie de los medios de cultivo y se apreció como no se superpusieron las colonias entre sí.

En los antagonismos evaluados enfrentando las cepas promisorias como biocontroladores, en un 66,5% fueron dominados por las cepas del hongo Trichoderma sp. y en el 23,2% por las cepas del hongo Aspergillus sp. Según la literatura, esto puede explicarse por la cantidad de enzimas hidrolíticas tales como las lignocelulolíticas, quitinolíticas, proteolíticas, y glucanolíticas producidas por Trichoderma sp., las cuales son excretadas como complejos enzimáticos y están involucradas en procesos como autólisis, germinación de esporas, ramificación y desarrollo de micelios, crecimiento de hifas, nutrición, separación de células y micoparasitismo, procesos esenciales en el control biológico. Igualmente, por la producción de metabolitos secundarios que cumplen funciones de supervivencia para los procesos de competencia, simbiosis, patogenicidad y autoprotección Figura 2. Control de crecimiento Sclerotinia sp. En medio jugo V8.[⁴⁰, ⁴¹]. Los hongos del género Aspergillus sp. También se caracterizan por producir enzimas hidrolíticas, la mayoría con gran potencial biotecnológico por su capacidad de degradar paredes celulares de plantas y producir ácidos orgánicos ⁴⁰].

En los cultivos de los enfrentamientos entre los consorcios y el fitopatógeno no se observó la presencia de esclerocios sin melanina y con melanina, característicos del crecimiento de Sclerotinia sp. Para su proceso de reproducción asexual después de los 5 a 7 días de cultivo en los que normalmente se forman, de acuerdo con lo reportado por Sousa-Melo et al. [¹¹]. Esto coincidió con los resultados obtenidos, puesto que en el control del fitopatógeno, estas estructuras se formaron a partir del octavo día de incubación. En los tratamientos mencionados no sé formaron esclerocios. La disminución del crecimiento del micelo de Sclerotinia sp. Fue mayor empleando a Trichoderma sp. y Aspergillus sp. En consorcios, pero al emplearlos en conjunto se inhibió la formación de esclerocios. Estas estructuras son la principal vía de infección del fitopatógeno y cuando germina puede hacerlo como micelio o cuerpo carpogénico. Asimismo, estas estructuras tienen la capacidad de permanecer viables por largos periodos de tiempo, y son resistentes a cambios adversos físicos y químicos, como a la degradación biológica [⁴²].

La inhibición de Sclerotinia sp. Por Trichoderma sp. ha sido ampliamente estudiado [³³, ⁴⁰-⁴²], pero no ocurre lo mismo con Aspergillus sp. Donde son pocos los estudios que evalúan el hongo Aspergillus sp. Como antagonista de fitopatógenos [³⁶, ³⁷]. En este estudio, se pudo evidenciar con los consorcios de los hongos Trichoderma sp. y Aspergillus sp. Frente a Sclerotinia sp., que la eficiencia de inhibición del fitopatógeno causante de la podredumbre blanca es más eficaz al trabajar con metabolismos provenientes de estos dos tipos de hongos. Esto coincide con lo descrito por Cologna et al. [⁴⁰], respecto al uso combinado de diversas enzimas provenientes de cuatro especies de Aspergillus sp. Con Trichoderma reesei para establecer el grado de sacarificación de la cascara de trigo, reportando que fue mayor el grado de sacarificación empleando el coctel de enzimas de Aspergillus sp. y Trichoderma sp., que cuando la cascara de trigo fue tratada solo con el hongo T. reesei. Estos resultados apoyan la conjetura sobre la eficiencia metabólica al emplear combinaciones de enzimas mixtas (i.e., enzimas del metabolismo primario y metabolitos secundarios).

El análisis del conglomerado jerárquico mediante la medida de similaridad de Jaccard permitió establecer la semejanza entre las relaciones antagónicas y su efecto sobre el fitopatógeno. Se obtuvo que en el consorcio As1+As2+Tr1 fueron mutualistas las cepas en un 95,1%, el consorcio solo logró inhibir en un 66,5% el crecimiento de Sclerotinia sp. Individualmente, las cepas As1 y Tr1 inhibieron en un 60,6% y en un 91,0% a As2 y Tr1, respectivamente; datos que fueron confirmados al realizar un análisis de varianza de un factor y la prueba Tukey, en donde se pudo encontrar que hubo una asociación entre estas dos cepas de hasta el 60,6% (en promedio), de acuerdo con la semejanza intergrupal realizada con un nivel de confianza del 95%.

Estadísticamente, el comportamiento del consorcio As1+As2+Tr2 fue similar entre las cepas con una eficiencia de inhibición de Scl. del 85,1% en conjunto, y de una inhibición del 95,6% y 95,11% por las cepas As1 y Tr2, respectivamente. Sin embargo, el grado de afinidad por estas dos cepas no fue superior al 9,66%, por lo cual en el tratamiento As1+As2+Tr2 contra Scl. disminuyó hasta un 12,9% el patógeno, de acuerdo con la comparación intergrupal de Tukey (Cuadro 6).

Cuadro 6

Se evidenció que en el consorcio As1+As2+Tr3, la inhibición no fue superior al 50,0%, aunque las cepas de Aspergillus sp. Fueron mutualistas entre ellas en un 85,7%. Sin embargo, la cepa Tr3 tuvo un crecimiento inferior al 28,1% y el efecto inhibidor sobre el fitopatógeno individualmente fue superior al 50,0% para cada cepa. Esto se evidenció en la comparación de medias porcentuales referente a la inhibición del fitopatógeno mediante un análisis de varianza y comparación intergrupal con prueba Tukey (Cuadro 7).

Con la prueba estadística de Tukey se corroboró que hubo un porcentaje de asociación del 66,5% entre las cepas As1, As2 y Tr1, y de 87,14% entre las cepas As1 As2 y Tr2; ambos consorcios con un nivel de confianza del 95% (Cuadro 7). Para todos los datos, se realizó una comprobación de homogeneidad, encontrando la correcta distribución de estos y sin variaciones atípicas al estudio realizado.

Cuadro 7

De acuerdo con el análisis de varianza y la prueba de Tukey, los tratamientos en consorcio fueron semejantes, aportando un grado de inhibición entre el 47,3-85,1%, en dónde se pudo encontrar que el cambio de la cepa de Trichoderma sp. Aportó en mayor o menor grado al control del fitopatógeno, lo cual se observó en los tratamientos individuales contra Sclerotinia sp., ya que los hongos As1 y Tr2 fueron mutualistas hasta en un 9,66%, razón por la cual el tratamiento del consorcio As1+As2+Tr2 solo fue efectivo hasta el 85%. También para As1 y As2, y As2 y Tr2 hubo un grado de afinidad de hasta el 70,9%, en ambas combinaciones.

Por otro lado, las cepas As2 y Tr1 fueron mutualistas hasta en un 90,9%, sin embargo, As1 y Tr1 se inhibieron entre sí en un 60,6%, por lo que el consorcio As1+As2+Tr1 solo logró un grado de efectividad de hasta el 66,5%. Por último, Tr3 fue mutualista con As1 y As2 en 76,8% y 7,21%, respectivamente, por esta razón, el grado de control de este consorcio sobre el fitopatógeno disminuyó considerablemente hasta el 47,1%. No obstante, cabe resaltar que en este último tratamiento tampoco se formaron estructuras de resistencia (esclerocios), pero si un mayor crecimiento del micelio de Scl.