Las coberturas de chocolate para las digestiones gastrointestinales in vitro se fabricaron basado en la Resolución 1511 del INVIMA (Ministerio de la Protección Social, 2011), aplicando un diseño 2⁴ más puntos centrales, con cuatro factores que describen los componentes principales de la formulación de cacao (Cuadro 1), con un total de 96 experimentos, teniendo el valor de porcentaje de bioaccesibilidad de Cd como variable de respuesta. El diseño de experimentos se ejecutó y se analizó mediante el software Statistica.

Cuadro 1. Descripción

Para la elaboración del licor de cacao, se tostaron los granos de cacao fermentados y secos a una temperatura de 120 °C durante 20 min. Luego, se retiró la cascarilla del grano de manera manual y se realizó una premolienda durante 2 min a 4 °C. Por último, se refinó el polvo de cacao resultante hasta obtener el licor. Una vez determinadas las cantidades de los ingredientes de las formulaciones por medio de los puntos del diseño experimental, se mezclaron manualmente las proporciones de licor de cacao, leche y azúcar y se refinaron hasta obtener una consistencia líquida y uniforme. Se suprimieron las etapss de atemperado y moldeado dado que solo afectan a la textura del producto.

Se cuantificó el contenido de Cd total presente en las coberturas de chocolate con base en el procedimiento propuesto por Echeverry y Reyes (2016). Se calcinaron aproximadamente 3 g de la muestra en una mufla a 600 °C durante 4 horas. Luego, se disolvieron en 10 mL de HCl 6 N y se llevaron a ebullición por 5 min. Por último, se filtró el contenido con papel filtro, se adicionaron 3 gotas de HNO₃ al 65 %, y se aforó a 25 mL. Las soluciones resultantes se analizaron por Espectrometría de Absorción Atómica (AAS) en llama utilizando un equipo PinAAcle 400 Perkin-Elmer provisto de gas de combustión aire-acetileno a una presión de 2,5 Pa y un flujo de 1 L/min. La absorbancia de las muestras se leyó directamente a una longitud de onda de 254 nm.

Los ensayos de digestión gastrointestinal in vitro se desarrollaron siguiendo el procedimiento descrito por Minekus et al. (2014) con modificaciones. Para la digestión gastrointestinal in vitro, se prepararon soluciones estándar electrolíticas (Cuadro 2) que simularon los fluidos de la digestión gástrica y digestión pancreática usando NaOH 1 M y HCl 6 M para ajustar y mantener el pH de las soluciones.

Cuadro 2. Composición

Para la digestión gástrica in vitro, se pesaron aproximadamente 5 g de cada formulación de chocolate y se mezclaron con 7,5 mL de SFG, se adicionaron 1,6 mL de solución de pepsina porcina de 25000 U/mL (se disolvió la pepsina en SFG), 5 µL de CaCl₂ 0,3 M y 0,8 mL de HCl 1 M para llegar a pH 3,0. Todo el procedimiento se realizó durante 2 horas con agitación constante, controlando la temperatura entre 36 y 37 °C y un valor de pH entre 2,9 y 3,1. Para la digestión pancreática in vitro, se adicionaron 11 mL de SFP a la solución resultante de la anterior digestión, luego se adicionaron 5 mL de solución de pancreatina de 800 U/mL (se disolvió la pancreatina con SFP), 2,5 mL de bilis al 0,5 %, 40 µL de CaCl₂ 0,3 M, 0,8 mL de NaOH 1 M para llegar a pH 7,0 y 0,3 mL de agua. El procedimiento tuvo una duración de 2 horas con agitación constante, controlando la temperatura entre 36 y 37 °C y un valor de pH entre 6,9 y 7,1.

La determinación del contenido de Cd bioaccesible se basó en la metodología propuesta por Barraza et al. (2017) con modificaciones: se adicionó la solución resultante de la digestión pancreática a un tubo cónico de 50 mL y se centrifugó a 4000 rpm por 10 min. Luego, se adicionó el sobrenadante a un vaso precipitado de 100 mL, se aagregaron 5 gotas de HNO₃ al 65 %, se agitó un poco hasta observar un precipitado y se filtró el contenido con papel filtro recogiendo el filtrado en un balón aforado de 50 mL. Por último, se aforó la solución a 50 mL y se analizó por AAS en llama utilizando como gas de combustión aire-acetileno a las mismas condiciones descritas para la cuantificación de cadmio total.

Se determinó la bioaccesibilidad del Cd (% Cd_bio) a partir de la Ecuación 1:

Donde [Cd bioaccesible] corresponde al contenido de Cd presente en la solución resultante de la digestión gastrointestinal sobre la cantidad de la formulación de chocolate utilizada en la digestión; y [Cd total] que es la concentración del Cd total de la formulación de chocolate.

Para determinar la correlación entre los componentes en las formulaciones de chocolate y la bioaccesibilidad de Cd, se usó un ANOVA a los resultados obtenidos. También, se evaluó por medio de superficie de respuesta, diagramas de Pareto y correlación de datos predichos con observados. Se realizó un ajuste de la ecuación que describió el porcentaje de bioaccesibilidad de Cd en función de los factores evaluados que fueron significativos (cacao, azúcar, leche en polvo y concentración de Cd en cacao).

Los datos obtenidos se ajustaron a un modelo matemático de efectos lineales con interacciones como se presenta en la Ecuación 2.

Donde Y es el porcentaje de bioaccesibilidad de Cd, X_n es el coeficiente de cada variable y A, B, C y D son las variables de cantidad de cacao, leche en polvo, azúcar y concentración de Cd en cacao respectivamente.

Finalmente, se procedió a determinar las concentraciones de los componentes de la formulación de chocolate que posea menor valor en la bioaccesibilidad de Cd.

Teniendo en cuenta la cantidad de leche en polvo que se utilizó para la elaboración del producto, a medida que este valor incrementa, el porcentaje de bioaccesibilidad también incrementa. Se corroboró que la leche en polvo no contribuye al contenido de Cd total a la formulación, sin embargo, el contenido de aminoácidos polares y de ácidos orgánicos es elevado. La presencia de un componente polar de gran proporción en las formulaciones de chocolate como la leche y, sumado a esto, el alto contenido de acidez presente en ella ayuda a liberar más iones de Cd²⁺ en la fase polar y aumentar la probabilidad de ser bioaccesible después de la digestión gastrointestinal (Cobbett & Goldsbrough, 2002).

A medida que la cantidad de azúcar usada en las formulaciones se incrementó, teniendo constantes las demás variables de la formulación, el porcentaje de bioaccesibilidad disminuyó. Aunque el efecto de la cantidad de azúcar es pequeño en comparación con el efecto de las otras variables (Figura 1), ésta es una variable significativa en el modelo inicial, lo que puede ser atribuido a la formación de complejos de Cd insolubles con la sacarosa y otros endulzantes en la fase intestinal de la digestión, reduciendo la concentración de Cd bioaccesible y, por ende, el porcentaje de bioaccesibilidad de Cd (Peixoto et al., 2016).

Al incrementar la concentración de Cd en el cacao, el porcentaje de bioaccesibilidad también incrementa, debido a que la matriz posee mayor cantidad de Cd que puede ser solubilizada y ser bioaccesible en las digestiones gastrointestinales.

De acuerdo con lo anterior, los datos se ajustaron a un nuevo modelo corregido de efectos lineales con interacciones, eliminando la interacción BD (cantidad de leche y [Cd] en cacao) la cual no fue significativa (Ecuación 3):

El modelo ajustado permitió explicar el comportamiento de los datos experimentales en un 94,01 %, observándose una tendencia lineal entre los datos experimentales y los obtenidos con el modelo ajustado (Figura 2).

Figura 2.

En la superficie de respuesta se puede observar una tendencia de los datos similares a la reportada en la gráfica de Pareto, con una disminución del porcentaje bioaccesibilidad Cd cuando la cantidad de cacao aumenta, y un aumento en el porcentaje bioaccesibilidad cuando las cantidades de leche aumentan (Figura 3).

Figura 3

Una vez obtenido el modelo matemático para describir el comportamiento del porcentaje bioaccesibilidad de Cd en las formulaciones de chocolate, se obtuvieron los valores de las variables que corresponden a formulaciones con el valor mínimo de bioaccesibilidad de Cd de 7,07 %, donde se obtuvo una formulación con 7 g de cacao, 0 g de leche y 2 g de azúcar, utilizando un cacao de 1,23 mg/kg de Cd. Así mismo, otros valores mínimos se obtuvieron para formulaciones de chocolate con otras concentraciones de Cd en el cacao y mayor cantidad (Cuadro 5). También, se obtuvo el valor experimental de la formulación de chocolate propuesta por el modelo ajustado, obteniéndose un error de 2,08 %.

Cuadro 5

Estos resultados muestran que las formulaciones de chocolate, para cualquier concentración de Cd del cacao utilizado dentro del intervalo del modelo (Cuadro 1), que poseen menor valor de porcentaje de bioaccesibilidad de Cd corresponden a chocolate negro o amargo (dark chocolate) donde el alto contenido de grasa puede favorecer a la retención del Cd en la digestión gastrointestinal, y la ausencia de compuestos ácidos, como la leche, puede evitar la liberación del Cd en su forma bioaccesible.

La evaluación del modelo ajustado se adelantó con formulaciones diferentes a los puntos experimentales utilizados para el modelo, se calculó el error del valor prestablecido por el modelo para 10 formulaciones experimentales donde se obtuvieron errores de 8,84 % en promedio (Cuadro 6).

Cuadro 6

El modelo se ajustó para las variables, sin embargo, el modelo puede aplicarse para grandes cantidades de cacao, leche y azúcar (A, B y C respectivamente) siempre y cuando se mantengan las proporciones estipuladas para este modelo (Cuadro 1). Esta afirmación se sustenta en resultados obtenidos (Cuadro 6) para formulaciones de mayor masa; por ejemplo, para una formulación de 4 kg, los valores experimental y presteblecido de bioaccesibilidad de Cd fueron 15,22 y 13,45 %, respectivamente, diferencia que representa tan solo un 11,64 % de error.

Los valores obtenidos de porcentaje de bioaccesibilidad de Cd para esta investigación se compararon con resultados reportados por otros autores (Cuadro 7). Si bien, las matrices utilizadas en los otros trabajos no son las mismas, utilizan como base cacao en los productos elaborados.

Cuadro 7

Una de las diferencias en el valor de porcentaje de bioaccesibilidad de Cd de este trabajo con el trabajo de Barraza y colaboradores es debido a que solo consideraron la digestión gástrica como procedimiento para determinar la fracción de Cd bioaccesible. Una de las razones de esta consideración es que ellos mencionan la probabilidad de absorción de Cd antes de entrar a la fase pancreática, pero es una hipótesis aún por confirmar (Barraza et al., 2017). También, modificaron las condiciones de la digestión para obtener altos porcentajes de bioaccesibilidad y maximizar los efectos de una posible intoxicación (Barraza et al., 2017).

Los valores de bioaccesibilidad del trabajo de Peixoto y colaboradores son menores a los reportados ya que ellos utilizaron diferentes formulaciones de polvo de bebida, algunas de las cuales con adiciones de compuestos funcionales que contribuyeron a una reducción del porcentaje bioaccesibilidad de Cd. Además, optimizaron la cantidad de bilis y el pH en las digestiones gastrointestinales, incluyendo adiciones de compuestos dietarios como pectina y celulosa, que condujeron a menores valores de bioaccesibilidad de Cd (Peixoto et al., 2016).